Mieux encore, si vous avez accès à une information génomique complète (comme c'est le cas pour de plus en plus d'organismes dont les génomes ont été séquencés) vous pouvez utiliser le spectromètre de masse pour identifier des protéines. Ainsi, si vous digérez la protéine XYZ (encore inconnue) à la trypsine et que vous en analysez les fragments par spectrométrie de masse, vous recevrez une liste de poids moléculaires. Un ordinateur peut facilement comparer les poids de cette liste avec les poids de toutes les séquences polypeptidiques codées par les cadres de lecture du génome qui nous intéresse, et identifier celles qui coïncident. Quand vous entendez un biochimiste dire qu'il a découpé une bande d'un gel SDS et l'a envoyé en mass spec, c'est tout juste ce qu'il a fait.

Il existe plusieurs types de spectromètres de masse. Ils portent des noms comprenant des sigles ésotériques comme TOF (time of flight), MALDI (matrix assisted laser desorption), ESI (electrospray ionisation), APCI (atmospheric pressure chemical ionisation), EI (electron impact), CI (chemical ionisation), FAB (fast atom bombardment), FD/FI (field desoprtion/ field ionisation), TSP (thermospray ionisation), Q (quadrupole), FT-ICR (Fourier transform-ion cyclotron resonance) etc.; ces sigles sont souvent combinés entre eux pour refléter la nature de l'appareil ou ce à quoi ils sont connectés (LC-MS = liquid chromatography -mass spectrometer, etc).

Le principe général de la spectrométrie de masse repose sur une ionisation du matériel et au voyage du matériel chargé vers un détecteur. On distingue plusieurs systèmes de spectrométrie de masse selon la technique d'ionisation et la technique de détection.

6.2.1.1 EI (electron ionization, jadis electron impact)

Ici, on utilise la chaleur pour faire perdre des électrons à un filament de tungstène ou de rhénium dans lequel passe un courant électrique. Ces électrons sont emportés par un champ magnétique induit par un aimant, ce qui cause la formation d'un faisceau d'électrons avec lequel les particules gazéifiées de notre échantillon vont entrer en contact. L'impact va briser les protéines en plus petits peptides et les ioniser.

Ici, c'est un faisceau d'atomes de gaz (argon ou xénon) de haute énergie (4-10 KeV) qui bombarde la substance à analyser. Cette énergie est transmise à nos peptides qui sont ejectés sous forme ionique (positive et négative). Si la source d'accélération (les deux éclairs dans la figure ci-haut) induit un courant positif, ce sont les ions négatifs qui seront accélérés vers le détecteur; si le courant induit est négatif, ce seront les ions positifs.

6.2.1.3 ESI (electrospray)

Ici, l'échantillon est d'abord soumis à un fort champ magnétique pour en ioniser les molécules. Celles-ci sont pulvérisées dans la chambre d'ionisation sous la forme de microgouttes pleines d'ions (comme si elles sortaient d'un pouiche-pouiche pour arroser les plantes), gouttes qui sont rapidement déshydratées par un courant de gaz chauffé (il s'agit le plus souvent d'azote). Le solvant disparaissant, les ions de même charge dans les gouttes finissent par ne plus pouvoir se supporter, la faisant exploser en plusieurs gouttelettes plus petites. Le processus se répète jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de solvant du tout, laissant des ions "nus" dans les airs.

Les charges sont distribuées sur les peptides de façon statistique; un même peptide peut en porter plusieurs. Un séchage plus rapide des gouttelettes favorise la multi-ionisation.

Une sectrométrie de masse utilisant l'ESI présente souvent ses résultats sous forme de m/z (ou masse / charge) pour présenter la proportion des différentes formes chargées d'un même peptide.

Le graphique ci-haut présente la distribution des ions détectés par un spectromètre de masse et distribués selon leur ration m/z. Comme la valeur de z (la charge) ne peut être qu'un nombre entier, il devient assez facile de déterminer quelle était la masse du peptide initial qui a fourni tous les ions. Dans ce cas-ci, on devine que ce peptide avait une masse de 1200 (car 1200/2=600; 1200/3=400; 1200/4=300; 1200/5=240; 1200/6=200 et 1200/7=171 et des poussières). Si l'ionisation avait été particulièrement efficace et qu'on n'avait pas eu d'ions monovalents, le pic m/z de 1200 n'aurait pas été là. Malgré cela, on aurait quand même pu déterminer que le peptide initial avait une masse de 1200 en identifiant le ppcm (le plus petit commun multiple, comme on disait à la petite école!) de 171, 200, 240, 300, 400 et 600.

L'échantillon est ensuite zappé avec un laser UV. L'énergie du laser est absorbée en quelques nanosecondes par la matrice qui chauffe très rapidement. Comme les peptides de l'échantillon sont associés à un nombre bien plus grand de molécules de la matrice, ce sont ces dernières qui absorbent le gros de l'énergie; les molécules peptidiques ne sont donc pas endommagés par le laser. Cette excitation énergétique a plusieurs effets. Elle cause d'abord la désoprtion de certains peptides qui sont expulsés. De plus, le transfert subit d'énergie de la matrice aux peptides peut les ioniser. (On peut observer des transferts de protons de la matrice vers les peptides; on peut aussi voir les peptides perdre des électrons ou en gagner. Le choix de la matrice joue un rôle important sur l'état ionique final de l'échantillon).

Comme toute cette opération se déroule entre une anode et une cathode, les ions sont ensuite propulsés en direction de l'électrode portant une charge inverse à la leur -et vers un détecteur. (Les peptides peuvent, mentionnons-le, porter de multiples charges; quoique dans le cas du MALDI, les peptides n'en portent d'habitude qu'une seule).

6.2.2 Détection

6.2.2.1 TOF (time of flight)

Cette technique prend en considération le temps que met un ion pour parcourir le chemin de la chambre d'ionisation au détecteur. Les ions plus gros mettent plus de temps que les plus petits.

Elle ne semble pas limitée par la taille des ions et est extrêmement précise. Elle est souvent combinée avec une méthode d'ionisation rapide comme le MALDI, qui permet de savoir exactement quand les particules ont pris leur envol à cause de la vitesse du processus MALDI (un rayon laser voyage en effet à la vitesse de...ah, vous le saviez déjà).

6.2.2.2 Analyse par double focus

Dépendant des champs électriques produits avec le courant passant dans les fils, seuls les ions avec un ratio m/z particulier se rendront jusqu'au détecteur au bout du quadripole. Les autres seront déviés sur les fils. En variant la force et la fréquence des champs, différents ions seront détectés, nous donnant ainsi leur spectre de masse. Ne vous fiez pas à la grosse flèche droite de la figure, qui ne vous indique que la direction générale. La course d'un ion dans un quadripole ressemble plus à celle d'une abeille saoûle.

6.2.2.4 FT-ICR (Fourier transfrom ion cyclotron resonance).

Ici, un piège à ions dans un champ magnétique statique et uniforme dans l'espace force les ions à adopter une orbite circulaire dans ledit champ; la fréquence de cette orbite dépend de la masse, de la vitesse et de la charge de l'ion. Des détecteurs suivent la course des ions et permettent d'en déterminer ces paramètres.

6.2.2.5 Piège à ions (ion trap)

Dans ce piège à ions, un autre type de quadrupole est capable de capturer les particules ionisées selon leur masse et leur charge, ainsi que selon le courant qu'on fait passer dans le quadrupole. C'est la trajectoire des ions capturés dans des conditions données de potentiel au niveau du quadrupole qui donne les informations sur m et z.

6.2.3.1 MS/MS ou MSⁿ

Cette technique commence par séparer les ions en les faisant passer à travers une série de trois quadrupoles qui sont réglés pour ne laisser passer que certains ions vers le détecteur (par exemple, un certain peptide tryptique). Un MS laisserait normalement passer tous les peptides issus d'une digestion protéique, et nous donnerait le poids de chacun. Dans le MS/MS, on commence par n'en laisser passer qu'un.

Le peptide qui réussit à passer entre dans une chambre où il est frappé par des molécules de gaz chargées qui brisent sa chaîne peptidique en un ou plusieurs endroits. Ces bris font en sorte que ce sont des morceaux du peptide tryptique qui finissent par arriver au détecteur. En sachant le poids théorique du peptide tryptique au départ et en comparant les poids des différents petits peptides qui en sont issus, on peut établir l'ordre des résidus contenu dans le fragment initial. Cette technique de MS/MS permet donc de séquencer un petit peptide.

Dans L'exemple ci-dessus, on a retardé l'onde verticale bleue d'un quart de longueur d'onde (λ / 4, ou encore π / 2 radiants) pour une résultante en hélice de pas droit. Si on avait plutôt avancé l'onde bleue de π / 2 par rapport à la rouge, on aurait obtenu une hélice de pas gauche. Pour une démonstration animée, veuillez vous référer à l'excellent site suivant.

Les structures secondaires n'absorbent pas de façon égale la lumière polarisée circulairement vers la droite et la lumière polarisée circulairement vers la gauche. On raisonnera que l'absorption préférentielle de l'une de ces deux polarisations résultera en une déviation de la résultante (au lieu d'un cercle, le tracé de la résultante entre la spirale tournant à droite et la spirale tournant à gauche donnera une ellipse).

Cette déviation est appelée dichroïsme circulaire. Elle permet d'établir un spectre (appelé CD spectra en anglais) de forme caractéristique pour trois structures secondaires retrouvées dans les protéines: l'hélice, le feuillet et la forme aléatoire (ou random coil), qui chacune présentent des asymétries structurales.

Le spectre CD est particulièrement approprié pour juger rapidement de l'état de repliement d'une protéine (ses hélices sont-elles bien hélicales comme prévu?); pour comparer la structure de protéines obtenues de sources différentes; pour analyser l'impact de mutations ponctuelles surt la structure d'une protéine; pour juger de la stabilité de la structure face à des changements environnementaux (pH, salinité); pour déterminer l'impact sur la structure de la présence d'un cofacteur comme un le zinc ou la magnésium.

On peut aussi suivre au fur et à mesure qu'il se déroule le déploiement d'une protéine au fur et à mesure qu'on la soumet à un traitement dénaturant.

La dénaturation d'une protéine risque d'être irréversible. Le CD nous permet de la suivre "en direct", et de juger si elle est encore réversible. Trouver les conditions dans laquelle une protéine peut plus facilement retrouver son état premier après une dénaturation partielle peut nous être d'un grand secours pour la conserver longtemps.