BCM-514

Biochimie des protéines

Réponses aux questions.

Chapitre 1:

Question 1.1: L'histidine, la lysine et l'arginine sont trois acides aminés basiques. Le pK de leur chaîne latérale est respectivement d'environ 6, 10,5 et 12,5. Lesquels de ces acides aminés sont les plus basiques? Et quel serait leur caractère à un pH à peu près neutre?

Réponse: Le pK décrivant l'équilibre NH₃⁺ <=> NH₂ est de 6 pour l'histidine. C'est donc dire qu'aux environs de pH 6, les deux formes sont en quantités équivalentes. Pour la lysine et l'arginine, ce pK est de 10,5 et de 12,5. Cela signifie que la chaîne latérale de ces acides aminés reste sous forme NH₃⁺ sur un bien plus grand spectre de pH; il faut monter le pH au-dessus de 10 et de 12 pour que NH₃⁺ se convertisse en NH2. Ces deux acides aminés ont donc un caractère basique plus important que l'histidine.

À pH à peu près neutre, l'histidine aurait un faible caractère basique, car l'équilibre NH₃⁺ <=> NH₂ serait déjà un peu déséquilibré vers la droite. Les deux autres acides aminés, par contre, sont résolument sous forme NH₃⁺ et ont donc un fort caractère basique.

Question 1.2: L’aspartame, cet édulcorant bien connu, est un simple dipeptide: l’aspartylphénylalanine méthyl ester. C’est le groupement carboxylique libre de la phénylalanine qui est estérifiée en C-O-CH3. Dessinez la structure de l’aspartame (vous pouvez aller voir à quoi ressemblent la phénylalanine et l'acide aspartique si vous voulez). Ionisez les groupes comme si le pH était à 7. Quels seraient les groupes à considérer pour estimer le pI de l’aspartame?

Réponse: Voyons d’abord ce que nous dit la question. L’aspartame est un dipeptide qui contient de l’aspartate et de la phénylalanine. Voici la structure de ces deux acides aminés:

On nous dit aussi que le groupe carboxylique de la phénylalanine est estérifié par par un goupe méthyl (un groupement ester forme un lien
-C - O - C- ):
||
O

Puisque l'extrémité carboxylique de la phénylalanine est occupée, le lien peptidique du dipeptide ne peut donc se former qu’entre le groupe carboxylique de l’acide aspartique et le groupe aminé de la phénylalanine methyl ester: (Vous pouvez orienter les groupes latéraux comme bon vous semble).

Point de vue pI maintenant: Le pI est le pH auquel les charges positives et négatives d’un peptide s’annulent. Dans le cas qui nous occupe, nous avions au départ cinq groupement chimiques ionisables:
- l’extrémité aminée de l’acide aspartique NH2 < - > NH₃⁺, pK= 9,6
- l’extrémité aminée de la phénylalanine NH2 < - > NH₃⁺, pK= 9,13^- l’extrémité carboxylique de l’acide aspartique COO^- < - > COOH, pK=2,19
- l’extrémité carboxylique de la phénylalanine COO^- < - > COOH, pK=1,83
- et finalement la chaîne latérale de l’acide aspartique COO^- < - > COOH, pK= 3,65

Le groupe carboxylique de la phénylalanine fait maintenant partie d’un lien ester C-O-C; il n’est donc plus ionisable. Le groupe carboxylique de l’acide aspartique et le groupe aminé de la phénylalanine sont maintenant unis par un lien peptidique; ils ne sont plus ionisables ni l’un ni l’autre.

Il ne reste donc que deux groupes ionisables: le groupe aminé de l’acide aspartique ainsi que le groupe carboxylique de sa chaîne latérale. Le pI de l’aspartame se calculera en trouvant le pH où l’ionisation de l’un compensera celle de l’autre.

Question 1.3: La proline est un acide iminé plutôt qu'aminé. Quelle est sa caractéristique principale donnant de l'importance à cette distinction?

Contrairement aux autres acides aminés, la proline n'a pas une chaîne latérale "pendant dans le vide", si vous me passez l'expression. Sa chaîne latérale se recourbe et vient former un lien avec le N du groupe aminé. Cet aspect aura une importance majeure sur l'influence de la proline sur les structures secondaires.

Question 1.4: Lequel de ces peptides est le plus acide? Le plus hydrophobe?
(a) MRHDCEILDFEWDEAGGEGDSETD
(b) MHGFHIKLKDKQLRRKKIPREWDKL
(c) FWYKPYWFVNAAVFWYALCDFYR
(d) AQNDFMLKCSEFKDYTREDCAQRD

(a) contient le plus de résidus acides (D et E); (c) contient le plus de résidus hydrophobes (A, V, L, I, P, W, F, Y).

Question 1.5: Certains organismes utilisent certains codons d'une manière différente. Quelles sont les limitations imposées à ce phénomène?

Les protéines que l'évolution a sélectionné ne peuvent pas supporter trop de mutations sans devenir non-fonctionnelles. Le changement d"identité d'un codon phénylalanine pour un codon tryptophane partout dans le génome causerait des dommages irréparables. L'utilisation alternative de codons est donc limitée à ce qui ne causera pas trop de dégâts. Des codons STOP peuvent dans certains cas coder pour un acide aminé sans causer de catastrophe, puisque cette modification ne change rien à la séquence des protéines en général. certaines organelles ayant leur propre génome, comme les mitochondries, peuvent utiliser des codons d'une façon différente du noyau. Il est alors peu probable que des gènes puissent facilement passer de l'un à l'autre, puisque ces gènes ne coderaient pas pour la même séquence protéique dans l'un et l'autre cas!

Question 1.6: Petit exercice sur l'internet. Rendez-vous sur le site du NCBI et cherchez les séquences en acides aminés des récepteurs nucléaires RXR alpha1, RXR beta1, et RXR gamma2 de la souris (mus musculus). Sauvez ces séquences quelque part en format texte et rendez-vous ensuite sur le site de l'institut européen de bioinformatique. Vous y trouverez une liste de plusieurs outils bioinformatiques. Choisissez le programme ClustalW qui sert à faire des alignements. (ClustalW est disponible ailleurs, aussi ne vous gênez pas si vous préférez un autre site). Pour comparer les trois séquences, copiez-collez chacune d'entre elles dans la fenêtre à cet effet, l'une à la suite de l'autre, en les séparant par le symbole > et le nom de la protéine, suivie par un point. En comparant l'alignement des trois séquences, où remarque-t-on le plus de disparité entre elles?

RXRalpha1. ---MDTKHFLP-------------------------------LDFSTQVNSSSLN----- 21
RXR beta1. MSWATRPPFLPPRHAAGQCGPVGVRKEMHCGVASRWRRRRPWLDPAAAAAAAGEQQALEP 60
RXRgamma2. ------------------------------------------------------------

RXRalpha1. ----------SPTGRGSMAVPSLHPS-LGPGIG--SPLGSPGQLHSPISTLSSPINGMGP 68
RXR beta1. EPGEAGRDGMGDSGRDSRSPDSSSPNPLSQGIRPSSPPGPPLTPSAPPPPMPPPP--LGS 118
RXRgamma2. ---------MATNKERLFAPGALGPGSGYPGAG--FPFAFPGALRGS------------P 37
. . . : : *. * * . * .. .

RXRalpha1. PFSVISSPMGPHSMSVPTTPTLGFGTGSPQLNSPMNP----VSSTEDIKPPLGLNGVLKV 124
RXR beta1. PFPVISSSMGSPGLPPPAPPGFSGPVSSPQINSTVSLPGGGSGPPEDVKPPVLGVRGLHC 178
RXRgamma2. PFEMLSPSFRGLGQPDLPKEMASLSVETQSTSS-----------------------EEMV 74
** ::*..: . . . . . : . .*

RXRalpha1. PAHPSGNMASFTKHICAICGDRSSGKHYGVYSCEGCKGFFKRTVRKDLTYTCRDNKDCLI 184
RXR beta1. PPPPGGPGAG--KRLCAICGDRSSGKHYGVYSCEGCKGFFKRTIRKDLTYSCRDNKDCTV 236
RXRgamma2. PSSPSPPPPPRVYKPCFVCNDKSSGYHYGVSSCEGCKGFFRRSIQKNMVYTCHRDKNCII 134
*. *. . : * :*.*:*** **** *********:*:::*::.*:*: :*:* :

RXRalpha1. DKRQRNRCQYCRYQKCLAMGMKREAVQEERQRGKDRNENEVESTSSANEDMPVEKILEAE 244
RXR beta1. DKRQRNRCQYCRYQKCLATGMKREAVQEERQRGKDK-DGDGDGAGGAPEEMPVDRILEAE 295
RXRgamma2. NKVTRNRCQYCRLQKCFEVGMSKEAVRNDRNKKKKEVKEEGSPDSYELSPQLEELITKVS 194
:* ******** ***: **.:***:::*:: *.. . : . . . : * :..

RXRalpha1. LAVEPKTETYVEAN--MGLNPSSPNDPVTN-----ICQAADKQLFTLVEWAKRIPHFSEL 297
RXR beta1. LAVEQKSDQGVEGPGATGGGGSSPNDPVTN-----ICQAADKQLFTLVEWAKRIPHFSSL 350
RXRgamma2. KAHQETFPSLCQLGKYTTNSSADHRVQLDLGLWDKFSELATKCIIKIVEFAKRLPGFTGL 254
* : . : . :. . : :.: * * ::.:**:***:* *: *

RXRalpha1. PLDDQVILLRAGWNELLIASFSHRSIAVKDGILLATGLHVHRNSAHSAGVGAIFDRVLTE 357
RXR beta1. PLDDQVILLRAGWNELLIASFSHRSIDVRDGILLATGLHVHRNSAHSAGVGAIFDRVLTE 410
RXRgamma2. SIADQITLLKAACLDILMLRICTRYTPEQDTMTFSDGLTLNRTQMHNAGFGPLTD-LVFA 313
.: **: **:*. ::*: :. * :* : :: ** ::*.. *.**.*.: * ::

RXRalpha1. LVSKMRDMQMDKTELGCLRAIVLFNPDSKGLSNPAEVEALREKVYASLEAYCKHKYPEQP 417
RXR beta1. LVSKMRDMRMDKTELGCLRAIILFNPDAKGLSNPGEVEILREKVYASLETYCKQKYPEQQ 470
RXRgamma2. FAGQLLPLEMDDTETGLLSAICLICGDRMDLEEPEKVDKLQEPLLEALRLYARRRDPAKP 373
:..:: :.**.** * * ** *: * .*.:* :*: *:* : :*. *.::: * :

RXRalpha1. GRFAKLLLRLPALRSIGLKCLEHLFFFKLIGDTPIDTFLMEMLEAPHQAT---------- 467
RXR beta1. GRFAKLLLRLPALRSIGLKCLEHLFFFKLIGDTPIDTFLMEMLEAPHQLA---------- 520
RXRgamma2. YMFPRMLMKITDLRGISTKGAERAITLKMEIPGPMPPLIREMLENPEMFEDDSSKPGPHP 433
*.::*:::. **.*. * *: : :*: *: .:: **** *.

RXRalpha1. -------------------------
RXR beta1. -------------------------
RXRgamma2. KASSEDEAPGGQGKRGQSPQPDQGP 458

Le N-terminus des trois protéines est très différent. La partie centrale est très homologue, et la partie C-terminale est similaire chez alpha et beta mais dissemblable chez gamma.

Chapitre 2

Question 2.1: Nommez trois types de liens qui peuvent aider à stabiliser la structure d’une protéine et nommez un agent qui peut contrecarrer chacun de ces liens.

De façon non-exhaustive:

ponts hydrogènes : chaleur, changement draconien de pH, étirement mécanique
interactions hydrophobes: détergents, solvants organiques
interaction électrostatiques: changement de pH, changement de salinité
Forces de Van der Waals: chaleur
ponts disulfures: agents réducteurs, qui changent les liens S-S en groupes -SH.

Question 2.2: Un cristal de déoxyhémoglobine mis en orésence de l'air se brise spontanément. Expliquez pourquoi et dites s'il s'agit d'un problème de structure primaire, secondaire, tertiaire ou quaternaire.

L'oxygène de l'air, en réagissant avec l'hémoglobine, cause un changement de conformation de sa structure tertiaire, ce qui déplace les composantes de la structure quaternaire les unes par rapport aux autres. Le cristal ne peut pas supporter une telle tension interne au niveau de toutes ses sous-unités et se désagrège.

Question 2.3: Vrai ou faux?

(a) Un acide aminé fréquemment présent dans une hélice alpha est forcément très rare dans un feuillet beta.	Faux
(b) Une hélice alpha est forcément hydrophobique	Faux
(c) Un feuillet beta s'étire très mal	vrai
(d) Une protéine devrait spontanément adopter sa structure tertaire, si on lui en donnait le temps	vrai
(e) Les chaperones aident à faciliter le repliement adéquat des protéines	vrai

Question 2.4: Une protéine contenant plusieurs ponts disulfures dans sa structure a besoin d'être chauffée davantage qu'une autre pour être dénaturée, précisément parce que les ponts disulfures (qui sont des liens covalents formés par l'oxydation de la cystéine et sont donc très solides) stabilisent la structure. Quel serait un moyen d'abaisser la température de dénaturation d'une telle protéine?

Ajouter un agent dénaturant, ou abaisser le pH pour réduire les cystines en cystéines.

Question 2.5: Pourquoi une fibre de kératine peut-elle être étirée beaucoup mieux qu'une fibre de collagène? Elles sont pourtant toutes les deux hélicales. Et pourquoi la soie, composée surtout de feuillets beta, est-elle difficile à étirer?

C’est l’orientation des ponts hydrogènes qui fait toute la différence. Dans une hélice alpha, ils sont orientés dans le même sens que la fibre; si une force mécanique étire la fibre et brise ces ponts, le relâchement de la force permettra à l’hélice de retrouver facilement sa forme première en réétablissant les même ponts. La fibre de collagène, elle, n’a pas de ponts hydrogènes intra-chaîne (bien qu’elle forme des ponts latéraux avec des chaînes voisines). Un feuillet beta a des ponts hydrogènes, mais orientés perpendiculairement à l’axe de la chaîne polypeptidique; si une force les brise, ils auront beaucoup moins de facilité à se reformer à leur position initiale que dans le cas d’une structure régulière comme une hélice.

Question 2.6: William Astbury a découvert que le patron de diffraction des rayons X par la laine montrait une structure répétée, avec une unité structurale espacée d'environ 0,54nm en direction de l'axe de la fibre. En chauffant la laine à la vapeur et en l'étirant, il obtenait la même unité répétée, mais avec une valeur de 0,70nm. En réchauffant la laine à la vapeur de nouveau, et en la laissant rétrécir, il retrouvait une valeur de 0,54nm. Bien que cette observation ait fournie un important indice quant à la structure moléculaire de la laine, Astubry ne fut pas capable de l’interpréter à l'époque. Étant donné votre compréhension actuelle de la structure des protéines, interprétez l'observation d'Astbury.

La structure répétée a de très fortes chances d’être une hélice. L’unité structurale espacées de 0,54nm est typique d’une hélice alpha (et nous savons de toute façon que la laine est faite de kératine, elle-même un assemblage d’hélices alpha).

En chauffant la laine à la vapeur et en l’étirant, on va briser les ponts hydrogènes qui stabilisent l’hélice alpha. Sa forme étirée doit maintenant avoir un espacement de 0,7 nm par tour, puisque c’est ce qu’on observe. De nouveaux ponts hydrogènes ont dû se former dans la conformation “étirée”. En rechauffant la laine et en la laissant rétrécir, on brise ces nouveaux ponts hydrogènes et on permet aux hélices alpha de retrouver leur conformation originale plus stable, avec un espacement de 0,54 nm, et de reformer les ponts hydrogènes originaux.

Question 2.7: Vous recherchez une protéine qui interagit avec l’hélice amphipathique d’un facteur de transcription de type leucine-zipper. Vos travaux de purification vous permettent d’isoler trois candidats dont voici une partie de la séquence en acides aminés. Lequel des candidats est le plus prometteur? Et pourquoi?

1: GQHGPIGPAGPKGPAG 2: EAFGHEWCQFLQCLQE 3: LILFIQEDFDAGKKELL

Le deuxième. Ces résidus ont une forte probabilité de se retrouver dans une hélice alpha (voir page 20, première partie des notes), et dans une telle hélice on peut voir qu’une des faces serait plutôt hydrophile et une autre plutôt hydrophobe.

Question 2.8: Il existe, chez plusieurs espèces, des protéines antigel. Expliquez pourquoi la structure de ces protéines n’est pas toujours la même malgré le fait qu’elle réussissent toutes à empêcher la croissance de cristaux de glace.
Leurs diverses sructures leur permet de se fixer sur différentes surfaces des cristaux de glace en croissance, et ainsi d’inhiber cette dernière.

Chapitre 3

Question 3.1: Le cuir est le produit du traitement de la peau des animaux avec des substances appelés tannins. Expliquez comment les tannins peuvent prévenir cette peau traitée d'une putréfaction rapide, et comment elle rend le cuir hydrofuge.

Les tannins comme l’acide tannique sont des polyphénols contenant un très grand nombre de cycles phénoliques hydrophobes. Ils forment des régions hydrophobiques autour des fibres de collagène qui constituent l’essentiel de la peau animale. Les mutliples liens hydrophobiques entre les tannins et plusieurs fibres de collagène permettent de ponter ces dernières en un réseau hydrophobe, ce qui rend le cuir imperméable. Comme il n’y a plus de place pour beaucoup d’eau dans ce réseau hydrophobique collagène-tannins, les bactéries n’en ont pas assez pour proliférer. La putréfaction du cuir est donc prévenue.

Question 3.2: Pour quelle raison la glycine se retrouve-t-elle répétée à tous les trois résidus dans une triple hélice de collagène?

Dans une telle hélice, à chaque trois résidus, la chaîne latérale doit être orientée vers l’intérieur de l’hélice. Seule la glycine a une chaîne assez petite pour cela (il s’agit d’un simple atome d’ hydrogène).

Question 3.3: Clostridium perfringens est une bactérie anaérobique très pathogène qui cause une forme de gangrène (ou destruction des tissus infectés). Cette bactérie synthétise un enzyme qui coupe avant le tripeptide Glycine-Proline-Tyrosine. Comment cet enzyme peut-il particulièrement expliquer le pouvoir invasif de Clostridium dans les tissus?

Le collagène, qui constitue une bonne partie du tissu conjonctif, est composé d’hélice très riches en glycine (1 résidu sur trois) et en proline. Le tripeptide G-P-Y a donc de fortes chances de se retrouver fréquemment dans le collagène, et ce dernier est donc un substrat de choix pour cet enzyme. En détruisant le collagène, C. perfringens peut aisément pénétrer profondément dans les tissus.

Question 3.4: Expliquez comment une modification comme la glycosylation d'une protéine peut expliquer l'insensibilité du cobra à son propre venin.

Un des agents du venin de cobra est la bungarotoxine, un inhibiteur d’acétylcholinestérase. Cette toxine compétitionne pour le site de liaison de l’acétylcholine dans les récepteurs cholinergiques nicotiniques. La toxine est elle-même beaucoup plus volumineuse que l’acétylcholine et n’est pas hydrolysable par l’activité acétylcholinestérase du récepteur.

La glycosylation d’un site voisin du récepteur pourrait permettre de masquer ce dernier à la volumineuse toxine, tout en laissant passer l’ acétylcholine de taille beaucoup plus réduite.

Question 3. 5: Suggérez un mécanisme permettant à une drogue d'interférer avec la signalisation pro-cancéreuse de la protéine Ras.

Ras doit être localisé à la membrane pour jouer son rôle dans la signalisation; cette localisation dépend de sa farnésylation. Une drogue qui inhibe la farnesyl transférase empêcherait donc Ras de jouer son rôle.

Question 3.6: Les résidus les plus souvent retrouvés au coeur des protéines globulaires sont Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Met, Cys, et Gly. Expliquez pourquoi.

Ils sont hydrophobes, et leur position loin de la surface de la protéine sera favorisée.

Question 3.7: Parmi les modifications suivantes, lesquelles jouent un rôle sur la charge des protéines? (a) phosphorylation (b) acétylation (c) carboxylation (d) S-acylation

Les trois premières. La phopshorylation ajoute un groupement -PO4^2-, l'acétylation se fait sur un groupement -NH3⁺ qui devient -NH- non chargé et la carboxylation ajoute un groupement -COO^-. La S-acylation se fait sur un groupement -SH non chargé et n'ajoute pas de charge.

Question 3.8: En quoi la sumoylation peut-elle contrer le mécanisme de dégradation de l'ubiquitine?

En plaçant une molécule de SUMO sur le site d'ubiquitination, le rendant inacessible.

Chapitre 4

Question 4.1: Le méthanol est extrêmement toxique parce qu’il est converti en formaldéhyde lors d’une réaction catalysée par l’enzyme alcool déhydrogénase:

NAD+ + methanol (CH3OH) ---> NADH + H+ + formaldehyde (HCHO)

Le traitement dans le cas d’ingestion de méthanol inclut l’administration d’une quantité d’éthanol sufisante pour complètement intoxiquer quelqu’un. Expliquez pourquoi on donne ainsi de l’éthanol au patient, en fonction de ce que vous savez du fonctionnement des enzymes.

Il s’agit de pratiquer une inhibition compétitive au site actif de l’alcool déhydrogénase. Plus elle doit convertir d’éthanol, moins elle convertit de méthanol et moins de formaldéhyde se retrouve formé.

Question 4.2: Sur le graphique suivant, dessiner la courbe correspondant à l'effet d'un inhibiteur compétitif, puis à celle d'un inhibiteur non-compétitif.

Question 4.3 Vrai ou faux? Une réaction enzymatique induit une modification structurelle irréversible de l'enzyme.

C'est faux.

Question 4.4 Quel est l'effet, sur le Vmax d'un enzyme, d'un inhibiteur non-compétitif?

Le Vmax baisse, car l'enzyme est moins efficace. Un inhibiteur compétitif n'affecte pas l'efficacité de l'enzyme, mais le fait travailler pour rien au lieu de s'occuper de son substrat normal.

Question 4.5 Quel est l'avantage à ce qu'un enzyme soit inhibé par le produit de sa réaction?

Une telle rétroaction négative permet à l'enzyme de ne fonctionner que quand son produit est en faible concentration; autrement dit, l'enzyme ne fonctionne que quand on a besoin de lui.

Question 4.6 Un inhibiteur compétitif peut-il être irréversible?

C'est peut-être une question de sémantique, mais d'habitude pour que la question se pose il faut qu'un inhibiteur compétitif ou non-compétitif soit réversible. Un inhibiteur irréversible amène le Vmax de l'enzyme à zéro pour de bon.

Chapitre 5

Question 5.1 Un polypeptide digéré par une protéase libère les peptides suivants. Ils sont purifiés sur une colonne échangeuse de cations. Donnez l’ordre de leur élution à pH 7 en utilisant un gradient de KCl de 100mM à 1M. Justifiez votre choix.

EEEDFPPGPHRQKKK
GGILPA
TSGKAY
GHACGF
DDEDEAA
VNRKGW.

La colonne est échangeuse de cations, c’est donc dire qu’elle est chargée négativement et qu’elle aura tendance à retenir les charges positives. Les résidus avec une chaîne latérale basique (H, R, K) seront donc retenus davantage que les autres. Comptons les charges positives de chacun des peptides:

EEEDFPPGPHRQKKK = 1 H, 1 R, 3K
GGILPA = rien
TSGKAY = 1 K
GHACGF = 1 H
DDEDEAA = rien
VNRKGW = 1 R, 1 K

GGILPA et DDEDEAA sortiront en premier parce qu’ils ne seront pas retenus par la résine. Ils ne contiennent pas d’acides aminés basiques. Ensuite, entre les deux peptides avec un résidu basique chacun, c’est GHACGF qui sortira le premier parce que son histidine est moins basique (pk = 6) que la lysine de TSGKAY ( pK= 10,53). VNRKGW sortira ensuite, avec ses deux charges positives et EEEDFPPGPHRQKKK sortira le dernier parce qu’il a 5 résidus basiques, même s’il en compte aussi 4 acides.

Question 5.2 Une purification par gradient de sucrose donne 12 fractions séparés en partant du haut du tube. Sur gel SDS, voici ce qu’elles donnent comme patron. Que signifie le patron de la piste 7?

Les protéines se sont séparées en fonction de leur densité, qui va souvent de pair avec leur poids moléculaire. La piste 7 présente une anomalie en ce qu’on y retrouve plusieurs protéines de poids très différents. On peut supposer que plusieurs de ces protéines étaient associées en un ou plusieurs complexes dont la densité globale était différente des densités individuelles de ses composantes.

Question 5.3 Vous purifiez sur colonne d’échange d’ions, avec un tamnpon Tris à pH 7, un polypeptide de séquence

GGLDNREDSARTILEKKERIEDQTHTSGPQMRHNVMRHNKLILDED.

Quel moyen de détection recommandez-vous pour suivre l’élution du peptide? Justifiez votre réponse.

Comme le peptide ne contient pas de tryptophane ou même de tyrosine, on ne peut pas utiliser la détection par spectrophotométrie à 280nm. Dans un tampon tris, la lecture à 200nm serait également impossible.

Du côté colorimétrique, on évitera les méthodes basées sur la réaction du Biuret, qui repose aussi sur la présence de W, Y ou C. (Il n’y a pas de C non plus dans le peptide!)

On pourrait utiliser la méthode de Bradford.

Question 5.4 Vous disposez d'un extrait cellulaire total duquel vous voulez extraire une glycoprotéine encore mal connue. Décrivez cinq techniques utilisées pour la purifier, si vous savez déjà qu'elle a un pI de 9, que sa séquence interne contient la séquence RRKGHHHHHHSM et qu'elle se lie à la protéine SP1. Justifiez vos choix et soulignez le ou les avantages de chacune des techniques que vous choisissez.

exemple de réponse acceptable:

1- Glycoprotéine: colonne d’affinité pour les protéines glycosylées, comme une WGA (wheat germ agglutinin) ou ConA (concanavalin A).
2- La protéine est très basique (pI de 9): chromatographie sur échangeuse de cations à pH 7-8.
3- Séquence interne contient HHHHHH: chromatographie d’affinité pour le métal immobilisé (IMAC), comme le Ni-NTA.
4- Elle se lie à SP1: chromatographie d’affinité avec une résine couplée à du SP1 recombinant.
5- Et finalement, on peut toujours enrichir une protéine par filtration sur gel.

Question 5.5 Vous purifiez un enzyme qui contient quatre sous-unités de 65 kD.

(a) Dans des conditions non-dénaturantes, dans quel pic d’élution d’une colonne de filtration sur gel (1 à 6, ci-contre) vous attendez-vous à retrouver cet enzyme?
(b) Sur gel SDS, quelle piste contiendrait l’enzyme?
(c) Et si on pontait les protéines au dimethylsuberimidaqte avant la purification?

réponse:
(a) Pic 1, qui pourrait correspondre à un tétramère de sous-unités de 65 kD (pour 260 kD).
(b) Le SDS va briser le tétramère en ses sous-unités de 65 kD: C’est probablement la piste C qui est la bonne, quoiqu’on ne puisse pas absolument exclure que le pic 1 ait aussi contenu des complexes contenant des sous-unités de 60 Kd et de poids moléculaires supérieurs comme on en retrouve dans la piste e.

(c) Si on pontait les sous-unités au suyberimidate, le patron ressemblerait à la piste e, qui contient des bandes correspondant à différentes combinaisons des sous-unités du complexe (65 + 130 + 195 + 260)

Chapitre 6

Question 6.1 Un spectromètre de masse peut donner des indications sur...
(a) la masse
(b) la structure tertiaire
(c) la structure primaire
(d) a et b
(e) a et c <-
(f) b et c

Question 6.2 Comment un spectromètre de masse pourrait-il être utilisé pour séquencer un polypeptide?

Le spectromètre de masse donne des informations sur la masse, mais comme les différentes combinaisons d’acides aminés ne donnent qu’un nombre limité de poids moléculaires possibles, il est possible de déterminer quels résidus se trouvent dans un fragment.

Le fractionnement du fragment en fragment plus petits permet d’identifier les résidus dans chacun d’entre eux, et l’alignement des résultats permet de déterminer l’ordre dans lequel on les retrouve dans le fragment initial.

Question 6.2 Pourquoi est-il important de déterminer l'identité de l'acides aminé se trouvant au bout d'un polypeptide pendant sa séquence par MS/MS?

Pour permettre d'orienter l'assemblage obtenu en "pesant" chaque fragment: en effet, la séquence ABC donne les fragments suivants: A, B, C, AB, BC et ABC qui ont exactement le même poids que les fragments C, B, A, CB, BA et CBA qu'on obtiendrait avec le peptide CBA.

Question 6.3 La microscopie de force atomique utilise-t-elle des lentilless optiques?

Non.

Question 6.4 Parmi les techniques suivantes, lesquelles peuvent être utilisées avec du matériel vivant?
(a) MS/MS
(b) Microscopie électronique à balayage
(c) microscopie à force atomique
(d) Protection à la DNAse I
(e) MALDI-TOF

(c) et (d), bien que le matériel puisse ne pas rester vivant bien longtemps après l'expérience.

Chapitre 7

Question 7.1 Quelle est l’importance de la charge d’une protéine sur la migration du complexe ADN-protéine dans un test d’EMSA?

De faible à insignifiante, car quelque soit la charge nette de la protéine dans le tampon utilisé, l’ADN, lui, est massivement négatif. C’est la charge de l’ADN qui décidera de la direction de la migration.

Question 7.2 Vous voilà responsable d’un étudiant d’été au labo. Votre jeune protégé est chargé d’exprimer dans E. coli une protéine de S. cerevisiae. Il doit d’abord cloner le gène de cette protéine, puis l’introduire dans les sites BamH I et EcoR I un vecteur d’expression.
Voici la séquence du gène:

L’étudiant décide de procéder par PCR et veut commander les oligonucléotides suivants pour aller “pêcher” le gène directement à partie du génome de S. cerevisiae:

5’ AAGGATCCATGGCTAGGATAGCAAGG 3’ et 5’ AAGAATTCCCTCTCCATAGCCAGAGC 3’

Vous approuvez sa stratégie, mais lui faites remarquer qu’il pourrait éviter bien des problèmes en modifiant la séquence et la longueur de ses oligos.
(a) Suggérez deux oligos plus avantageux, en ne dépassant pas 50 bases pour chacun d’entre eux.
(b) Expliquez votre choix.

La stratégie est bonne, mais comme on veut exprimer une protéine de levure avec une machinerie de E. coli, il faut s’assurer que les codons choisis pourront être utilisés. Les annexes de la page 9 de la première partie des notes de cours nous montrent que dans la séquence ci-haut, deux codons sont sous-représentés chez E. coli par rapport à S. cerevisiae: il s’agit de AGG pour l’arginine (2% chez E. coli vs 21% chez S. cerevisiae) et ATA pour l’isoleucine (7% vs 27%). Ces codons devraient être changés pour des codons plus favorables chez E. coli, comme par exemple CGC pour R et ATC pour I. Cela peut se faire en même temps que le PCR destiné à aller “pêcher” la séquence du gène, en utilisant des oligonucléotides portant des mutations par rapport à la séquence initiale.

Le premier oligo pourrait donc être

5’ AA (pour laisser au site BamHI un peu de séquence flanquante) GGATCC (le site Bam) ATG GCT CGC (site R modifié) ATC (site I modifié) GCA CGC ATC ACT GAA TTG TTA GAG ATG 3’

(j’ai laissé 18 nucléotides sans mutation après la dernière mutation, pour permettre un bon appariement de la partie 3’ de l’amorce).

Les codons du milieu de la protéine sont fréquents chez les deux organismes. C’est à la fin qu’on retrouve un AGG pour R, qui est rare chez E. coli. On en profite pour le muter avec le second oligo.
La deuxième amorce pourrait donc être, en considérant qu’elle pointe dans la direction opposée au cadre de lecture et qu’on doit donc synthétiser le brin complémentaire à celui qui est vu ci-haut:

5’ AA (un peu de séquence flanquante pour l’enzyme de restriction) GAATTC (le site EcoR I) GCG CTC CAT AGC CAG AGC ACT 3’

Les bases soulignées correspondent au brin complémentaire du codon CGC qui est très fréquent pour R chez E. coli.

Question 7.3 Pourquoi ne peut-on pas faire un gel de protéines de type SDS-PAGE, mais en omettant le SDS et le beta-mercaptoethanol pour que les prot.éines restent à l'état natif?

On peut en effet omettre le beta-mercaptoethanol pour ne pas briser les ponts disulfures, mais il n'est pas possible de se passer du SDS. Sans la charge uniforme en fonction de la masse que confère le SDS, les protéines ne se sépareraient pas en fonction de leur masse mais en fonction de leur masse ET de leur charge, ce qui les enverraient aussi bien vers l'anode que vers la cathode. La seule façon de faire un gel de protéines non-dénaturant est de faire un électrofocusing, qui sépare les protéines en fonction de leur charge seule et non de leur masse.

Question 7.4 Lors de la ligation d'un adapteur double-brin au bout d'un brin d'ADN lors d'une réaction de LMPCR, pourquoi l'adapteur a-t-il une extrémité prohéminente?

Pour éviter que plusieurs adapteurs ne se liguent bout à bout.

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