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5.3.2.2.3 Western blot et Dot blot
Il existe un outil extrêmement précieux peut nous renseigner sur la présence ou l'absence de notre protéine: un anticorps.
Les anticorps sont des protéines complexes fabriquées par les plasmocytes, des lymphocytes B stimulés pendant une réponse immunitaire. Les anticorps circulent dans le sang comme des missiles à tête chercheuse; ils sont sélectionnés pour reconnaître avec une grande spécificité une structure chimique particulière qu'on appelle antigène, qui se retrouve sur les corps étrangers. (Toute partie d'un corps étranger qui sert de base à la sélection d'un anticorps par le système immunitaire est par définition un antigène).
On peut immuniser différents animaux pour les induire à fabriquer des anticorps contre les protéines qui nous intéressent. Le sérum de ces animaux fournit alors le matériel dont nous avons besoin pour identifier, au milieu d'une soupe de protéines, celle que nous voulons en particulier.
Alternativement, si notre protéine est le fruit du génie génétique, nous lui aurons peut-être greffé un petit bout de séquence antigénique qui sera reconnu par un anticorps commercial. C'est ainsi que l'étiquette FLAG de Sigma (DYKDDDDK) ou la série d'histidines (HHHHHH) parfois utilisée pour faciliter la purification par chromatographie d'affinité pour un métal immobilisé (IMAC, pour immobilized metal affinity chromatography) sont reconnues par des anticorps commerciaux; toute protéine qui les porte sera identifiée par les anticorps respectifs.
Un anticorps spécifique à notre protéine, ou spécifique à une étiquette que nous lui avons greffée, peut être utilisé pour révéler la présence de la protéine sur une membrane après un transfert à partir d'un gel (SDS ou de focalisation isoélectrique) ou, plus rapidement, une membrane sur laquelle on a directement déposé un certain volume de solution contenant la protéine. Dans le premier cas on parle de western blot (un jeu de mots sur la technique du Southern blot, développée par le Dr Southern, et qui est basée sur le transfert d'ADN sur une membrane). Dans le second cas, on parle de dot blot ou de slot blot parce que le dépôt de la protéine sur la membrane se fait souvent avec l'aide d'un masque n'exposant que de petites parties de la membrane, avec des trous de forme ronde (dot blot) ou en forme de fentes (slot blot).
Dans la figure ci-dessous, on représente le transfert des protéines d'un gel SDS à une membrane pouvant être ensuite traitée avec un anticorps. L'anticorps va coller sur sa protéine-cible. Un deuxième anticorps, qui reconnaît la partie Fc du premier, est alors appliqué pour révéler la présence de ce dernier. Ce second anticorps est d'ordinaire couplé à un enzyme quelconque dont l'activité est facilement décelable: il s'agit le plus souvent d'une phosphatase alcaline dont l'action sur des substrats adéquats causera la production de photons (lumière!) ou l'apparition locale d'une coloration foncée.
De tels anticorps secondaires de même que les systèmes pour révéler leur présence sont disponibles chez de très nombreux fournisseurs de réactifs biologiques.
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Il est très utile de faire un double de notre gel de SDS, en faisant courir les mêmes échantillons, dans le même ordre, sur un autre gel qu'on fait courir en parallèle. Alors que le premier gel sert au western blot, le deuxième est coloré au bleu de Coomassie ou au nitrate d'argent (beaucoup plus sensible) afin de juger du degré d'enrichissement de la protéine révélée par l'anticorps. |
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